Флуорофор (або флуорохром, подібно до хромофора ) — це флуоресцентна хімічна сполука, яка може повторно випромінювати світло під час світлового збудження. Флуорофори зазвичай містять кілька комбінованих ароматичних груп або планарних або циклічних молекул з кількома π-зв’язками. ^[1]

Флуорофори іноді використовуються окремо, як індикатори в рідинах, як барвник для фарбування певних структур, як субстрат для ферментів або як зонд чи індикатор (коли на його флуоресценцію впливають такі аспекти середовища, як полярність або іони). У більш загальному випадку вони ковалентно зв’язані з макромолекулами, слугуючи маркерами (або барвниками, або мітками, або репортерами) для афінних або біоактивних реагентів ( антитіл, пептидів, нуклеїнових кислот). Флуорофори, зокрема, використовуються для фарбування тканин, клітин або матеріалів у різноманітних аналітичних методах, таких як флуоресцентне зображення та спектроскопія.

Флуоресцеїн через його аміноактивну ізотіоціанатну похідну флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) був одним із найпопулярніших флуорофорів. Від мічення антитіл застосування поширилося на нуклеїнові кислоти завдяки карбоксифлуоресцеїну. Іншими історично поширеними флуорофорами є похідні родаміну (TRITC), кумарину та ціаніну. ^[2] Новіші покоління флуорофорів, багато з яких є запатентованими, часто працюють краще, будучи більш фотостабільними, яскравішими або менш чутливими до рН, ніж традиційні барвники з порівнянним збудженням і випромінюванням. ^{[3] [4]}

Флуорофор поглинає світлову енергію певної довжини хвилі та повторно випромінює світло з більшою довжиною хвилі. Поглинені довжини хвилі, ефективність передачі енергії та час до випромінювання залежать як від структури флуорофора, так і від його хімічного середовища, оскільки молекула у своєму збудженому стані взаємодіє з навколишніми молекулами. Довжини хвилі максимального поглинання (≈ збудження) і випромінювання (наприклад, поглинання/випромінювання = 485 нм/517 нм) є типовими термінами, що використовуються для позначення даного флуорофора, але весь спектр може бути важливим для розгляду. Спектр довжини хвилі збудження може бути дуже вузькою або ширшою смугою, або весь спектр може перевищувати межу. Спектр випромінювання зазвичай гостріший, ніж спектр збудження, і має більшу довжину хвилі та, відповідно, меншу енергію. Енергія збудження коливається від ультрафіолетового до видимого спектра, а енергія випромінювання може тривати від видимого світла до ближньої інфрачервоної області.

Основними характеристиками флуорофорів є:

• Максимальна довжина хвилі збудження та випромінювання (виражена в нанометрах (нм)): відповідає піку в спектрах збудження та випромінювання (зазвичай по одному піку в кожному).
• Молярний коефіцієнт поглинання (у моль ^-1 см ^-1 ): пов'язує кількість поглиненого світла на даній довжині хвилі з концентрацією флуорофора в розчині.
• Квантовий вихід : ефективність енергії, що передається від падаючого світла до випромінюваної флуоресценції (кількість випущених фотонів на поглинений фотон).
• Тривалість життя (у пікосекундах): тривалість збудженого стану флуорофора до повернення в основний стан. Це стосується часу, необхідного для розпаду популяції збуджених флуорофорів до 1/ e (≈0,368) від початкової кількості.
• Стоксів зсув : різниця між максимальною довжиною хвилі збудження та максимальною емісією.
• Темна фракція : частка молекул, неактивних у випромінюванні флуоресценції. Для квантових точок тривала одномолекулярна мікроскопія показала, що 20-90% усіх частинок ніколи не випромінюють флуоресценцію. ^[5] З іншого боку, кон’юговані полімерні наночастинки (Pdots) майже не демонструють темної фракції у своїй флуоресценції. ^[6] Флуоресцентні білки можуть мати темну фракцію через неправильне згортання білка або дефектне утворення хромофора. ^[7]

Ці характеристики обумовлюють інші властивості, включаючи фотовідбілювання або фотостійкість (втрата флуоресценції при постійному збудженні світлом). Необхідно враховувати й інші параметри, як-от полярність молекули флуорофора, розмір і форму флуорофора (тобто для картини поляризаційної флуоресценції ) та інші фактори можуть змінити поведінку флуорофорів.

Флуорофори також можна використовувати для гасіння флуоресценції інших флуоресцентних барвників або для передачі їх флуоресценції на навіть довших хвилях.

Більшість флуорофорів є невеликими органічними молекулами з 20–100 атомів (200–1000 Дальтон ; молекулярна маса може бути вищою залежно від модифікацій щеплення та кон’югованих молекул), але є також набагато більші природні флуорофори, які є білками : зелений флуоресцентний білок (GFP) становить 27 кДа, а кілька фікобіліпротеїнів (PE, APC...) мають ≈240 кДа. Станом на 2020 рік найменший відомий флуорофор вважався 3-гідроксіізонікотинальдегідом, сполукою з 14 атомів і лише 123 Да. ^[8]

Флуоресцентні частинки, як квантові точки (2–10 діаметр нм, 100–100 000 атомів) також вважаються флуорофорами. ^[9]

Розмір флуорофора може стерично перешкоджати міченій молекулі та впливати на полярність флуоресценції.

Молекули флуорофора можуть бути використані окремо або служити флуоресцентним мотивом функціональної системи. На основі молекулярної складності та синтетичних методів молекули флуорофора можна загалом класифікувати на чотири категорії: білки та пептиди, невеликі органічні сполуки, синтетичні олігомери та полімери та багатокомпонентні системи. ^{[10] [11]}

Флуоресцентні білки GFP, YFP і RFP (зелений, жовтий і червоний відповідно) можуть бути приєднані до інших специфічних білків з утворенням злитого білка, який синтезується в клітинах після трансфекції відповідного плазмідного носія.

Небілкові органічні флуорофори належать до наступних основних хімічних груп:

• Похідні ксантена : флуоресцеїн, родамін, орегонський зелений, еозин і техаський червоний
• Похідні ціаніну : ціанін, індокарбоціанін, оксакарбоціанін, тіакарбоціанін і мероціанін
• Похідні скварейну та кільцезаміщені скварейни, включаючи барвники Seta та Square
• Похідні скварейну ротаксану(інші мови) : див. Тау-барвники
• Похідні нафталіну (похідні дансилу і продану(інші мови) )
• Похідні кумарину
• Похідні оксадіазолу : піридилоксазол, нітробензоксадіазол і бензоксадіазол
• Похідні антрацену : антрахінони, включаючи DRAQ5, DRAQ7 і CyTRAK Orange
• Похідні пірену : каскадний синій(інші мови) та ін.
• Похідні оксазину : нільський червоний, нільський блакитний, крезиловий фіолетовий, оксазин 170(інші мови) та ін.
• Похідні акридину : профлавін, акридиновий оранжевий, акридиновий жовтий та ін.
• Похідні арилметину : аурамін, кристалічний фіолетовий, малахітовий зелений
• Похідні тетрапіролу : порфін, фталоціанін, білірубін
• Похідні дипіррометену: BODIPY, аза-BODIPY

Ці флуорофори флуоресцюють завдяки делокалізованим електронам, які можуть стрибати через смугу та стабілізувати поглинену енергію. Наприклад, бензол, один із найпростіших ароматичних вуглеводнів, збуджується при 254 нм і випромінює на 300 нм. ^[12] Це відрізняє флуорофори від квантових точок, які є флуоресцентними наночастинками напівпровідника.

Вони можуть бути приєднані до білків до певних функціональних груп, таких як аміногрупи ( активний ефір, карбоксилат, ізотіоціанат, гідразин ), карбоксильні групи ( карбодиімід ), тіол ( малеімід, ацетилбромід ) і органічний азид (через клацальну хімію або не- зокрема ( глутаровий альдегід )).

Крім того, можуть бути присутні різні функціональні групи, що змінюють їхні властивості, наприклад розчинність, або надають особливі властивості, наприклад борна кислота, яка зв’язується з цукрами, або кілька карбоксильних груп для зв’язування з певними катіонами. Якщо барвник містить електронодонорну та електроноакцепторну групи на протилежних кінцях ароматичної системи, цей барвник, ймовірно, буде чутливим до полярності навколишнього середовища ( сольватохромний ), тому його називають чутливим до середовища. Часто барвники використовуються всередині клітин, які непроникні для заряджених молекул; в результаті цього карбоксильні групи перетворюються в складний ефір, який видаляється естеразами всередині клітин, наприклад, фура-2АМ і флуоресцеїн-діацетат.

Наступні родини барвників є групами торгових марок і не обов’язково мають структурну подібність.

• CF барвник (біотій)
• Зонди DRAQ і CyTRAK ( BioStatus )
• BODIPY ( Invitrogen )
• EverFluor (Setareh Biotech)
• Alexa Fluor (Invitrogen)
• Bella Fluor (Setareh Biotech)
• DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
• Атто і Трейсі ( Сігма Олдріх )
• FluoProbes ( Інтерхім )
• Барвники Abberior (Абберіор)
• Барвники DY та MegaStokes (Dyomics)
• Барвники Sulfo Cy (Cyandye)
• HiLyte Fluor (AnaSpec)
• Барвники Seta, SeTau і Square (SETA BioMedicals)
• Барвники Quasar і Cal Fluor ( Biosearch Technologies )
• Барвники SureLight ( APC, RPE PerCP, Phycobilisomes ) (Columbia Biosciences)
• APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
• Vio Dyes (Miltenyi Biotec)

Скорочення:

• Ex (нм): довжина хвилі збудження в нанометрах
• Em (нм): довжина хвилі випромінювання в нанометрах
• MW: Молекулярна маса
• QY: Квантовий вихід

Скорочення:

• Ex (нм): довжина хвилі збудження в нанометрах
• Em (нм): довжина хвилі випромінювання в нанометрах
• MW: Молекулярна маса
• QY: Квантовий вихід
• BR: Яскравість: молярний коефіцієнт поглинання * квантовий вихід / 1000
• PS: фотостабільність : час [сек] для зменшення яскравості на 50%

Флуорофори мають особливе значення в галузі біохімії та дослідження білка, наприклад, в імунофлуоресценції, клітинному аналізі, ^[15] імуногістохімії ^{[3] [16]} і датчиках малих молекул. ^{[17] [18]}

Флуоресцентні барвники знаходять широке застосування в промисловості під назвою «неонові кольори», такі як:

• Розширені косметичні формули
• Засоби захисту та одяг
• Органічні світлодіоди (OLED)
• Образотворче мистецтво та дизайн (плакати та живопис)
• Використання багатотонних накипів у фарбуванні текстилю та оптичних відбілювачів у пральних засобах
• Барвники в хайлайтерах для створення ефекту блиску
• Сонячні панелі для збору більшої кількості світла/довжин хвиль

• Флуоресцентний морський барвник використовується, щоб допомогти повітряним пошуково-рятувальним командам знаходити об'єкти у воді

• Категорія:Флуоресцентні барвники
• Флуоресценція в біологічних дослідженнях
• Гасіння флуоресценції
• Відновлення флуоресценції після фотовідбілювання (FRAP) – програма для кількісного визначення рухливості молекул у ліпідних подвійних шарах.

1. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). Chapter 3 Dyes and Fluorochromes. Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. с. 61—95. ISBN 978-1-68108-519-7. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
2. ↑ Rietdorf J (2005). Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. Berlin: Springer. с. 246—9. ISBN 3-540-23698-8. Процитовано 13 грудня 2008.
3. ↑ ^{а б} Tsien RY; Waggoner A (1995). Fluorophores for confocal microscopy. У Pawley JB (ред.). Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press. с. 267—74. ISBN 0-306-44826-2. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
4. ↑ Lakowicz, JR (2006). Principles of fluorescence spectroscopy (вид. 3rd). Springer. с. 954. ISBN 978-0-387-31278-1.
5. ↑ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). Single-molecule colocalization studies shed light on the idea of fully emitting versus dark single quantum dots. Small. 7 (14): 2101—2108. doi:10.1002/smll.201100802. PMID 21710484.
6. ↑ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). Hydroxy-terminated conjugated polymer nanoparticles have near-unity bright fraction and reveal cholesterol-dependence of IGF1R nanodomains. ACS Nano. 7 (2): 1137—1144. doi:10.1021/nn3042122. PMC 3584654. PMID 23330847.
7. ↑ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. PNAS. 97 (13): 7237—7242. Bibcode:2000PNAS...97.7237G. doi:10.1073/pnas.97.13.7237. PMC 16529. PMID 10860989.
8. ↑ Cozens, Tom (16 грудня 2020). Fluorescent molecule breaks size record for green-emitting dyes. chemistryworld.com. Процитовано 3 грудня 2021.
9. ↑ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). Recent advances in green fabrication of luminescent solar concentrators using nontoxic quantum dots as fluorophores. J. Mater. Chem. C. 7 (40): 12373—12387. doi:10.1039/C9TC03520F.
10. ↑ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013), Fluorophores and Their Applications as Molecular Probes in Living Cells, Curr. Org. Chem., 17 (6): 564—579, doi:10.2174/1385272811317060003
11. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). Chapter 4 Fluorescent Labels. Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. с. 96—134. ISBN 978-1-68108-519-7. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
12. ↑ Omlc.ogi.edu
13. ↑ ^{а б в г} Columbia Biosciences [Архівовано 2024-08-21 у Wayback Machine.]
14. ↑ Bindels, Daphne S.; Haarbosch, Lindsay; van Weeren, Laura; Postma, Marten; Wiese, Katrin E.; Mastop, Marieke; Aumonier, Sylvain; Gotthard, Guillaume; Royant, Antoine (January 2017). mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods (англ.). 14 (1): 53—56. doi:10.1038/nmeth.4074. ISSN 1548-7105. PMID 27869816.
15. ↑ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019). Enhanced in vivo Optical Imaging of the Inflammatory Response to Acute Liver Injury in C57BL/6 Mice Using a Highly Bright Near-Infrared BODIPY Dye. ChemMedChem (англ.). 14 (10): 995—999. doi:10.1002/cmdc.201900181. ISSN 1860-7187. PMID 30920173.
16. ↑ Taki, Masayasu (2013). Chapter 5. Imaging and sensing of cadmium in cells. У Astrid Sigel (ред.). Cadmium: From Toxicology to Essentiality. Metal Ions in Life Sciences. Т. 11. Springer. с. 99—115. doi:10.1007/978-94-007-5179-8_5. PMID 23430772.
17. ↑ Sirbu, Dumitru; Butcher, John B.; Waddell, Paul G.; Andras, Peter; Benniston, Andrew C. (18 вересня 2017). Locally Excited State-Charge Transfer State Coupled Dyes as Optically Responsive Neuron Firing Probes (PDF). Chemistry - A European Journal. 23 (58): 14639—14649. doi:10.1002/chem.201703366. ISSN 0947-6539. PMID 28833695.
18. ↑ Jiang, Xiqian; Wang, Lingfei; Carroll, Shaina L.; Chen, Jianwei; Wang, Meng C.; Wang, Jin (20 серпня 2018). Challenges and Opportunities for Small-Molecule Fluorescent Probes in Redox Biology Applications. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (6): 518—540. doi:10.1089/ars.2017.7491. ISSN 1523-0864. PMC 6056262. PMID 29320869.

• База даних флуоресцентних барвників
• Таблиця флуорохромів
• Довідник з молекулярних зондів – всебічний ресурс із флуоресцентної технології та її застосування.